高效液相制备纯化技术是一种在生物医药行业中非常关键的纯化技术，利用不同的化学性质来分离混合物中的各种组分。在医药研发领域，完整的杂质研究和充分的杂质控制，直接关系到药品的安全性和有效性，是药物成功获批的重要因素之一。

然而，杂质研究的难点在于识别和控制那些在生产过程中或稳定性研究中产生的未知且顽固的杂质。这些杂质的生成机制复杂，结构未知，难以通过常规方法进行追踪和分析。在这一挑战面前，制备液相技术成为解决难题的利器。作为一种高效的分离技术，PLC能够从复杂的样品中分离出微量的杂质，为进一步的结构鉴定和毒性评估提供了可能。这不仅解决了杂质研究中的关键难题，也为药品的安全性和有效性提供了更为坚实的保障。

美迪西云讲堂邀请工艺分析部李墨，为您深入解析HPLC操作的关键注意事项，并提供解决常见操作难题的策略和方法。

点击下方“https://www.hangzhouaijunshengwu.com/video/hplc-technology.shtml”，回顾李墨老师的整场直播。

01 刚提到的降低柱温用来增加化合物保留，但是我遇到过升高柱温化合物保留也增加的情况，这是什么原因呢？

李墨：在色谱分析中，通常降低柱温，溶质的保留时间会增加。在少数情况下，我们化合物的保留时间会随着温度增加而增加，原因可能是溶质分子产生了离子化，或者跟溶质分子的结构有关系，或者固定相可能会随着温度改变，都可能导致保留时间的增加。

02 制备样品的溶解性要怎么试？有什么好的建议呢？

李墨：首先拿到样品之后，建议是先咨询合成部门同事，询问化合物是从什么溶剂中旋蒸出来的，了解化合物的原始溶剂。或者进行尝试，可以称取几个约10毫克的样品于进样小瓶中，准备进行溶解性测试。向每个样品中加入100微升的稀释剂，观察其溶解性。如果样品不溶，可以逐步增加稀释剂量。如果观察到样品在中性条件下不溶，可以考虑加入少量的酸或碱以帮助溶解。常用的溶剂一般可以考虑使用甲醇乙腈，如果这些溶剂无法溶解样品，可以尝试更通用的溶剂，如二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）或N-甲基吡咯烷酮（NMP）。这些试溶解性的样品后续可以用来进行方法开发，也不浪费样品。

03 什么是预饱和？目的是什么？

李墨：预饱和技术在色谱分析中扮演着重要的角色，其主要目的是保护色谱柱，并维持其性能的稳定性。预饱和可以防止色谱柱内的固定液流失，在流动相进入色谱系统之前，预饱和柱会对流动相进行处理，使其与固定液充分接触，达到饱和状态。饱和之后再进入分析柱当中，就会防止分析柱中的固定液流失，从而保持我们色谱柱的性能不变。

04 保护柱不能超声应该怎么清洗？

李墨：直播提到保护柱不能够剧烈超声，是因为可能会对填料产生一定损伤，如果保护柱出现污染，可以将其拧开并拆开，取出柱芯，使用50%异丙醇溶液进行清洗，以去除表面吸附的样品。发生一些强污染的时候，可以像常规的色谱柱一样进行单独的冲洗，把污染物冲出来。要注意定期检查保护柱的理论塔板数，以评估柱效是否下降。同时注意压力是否异常上升，这些可能是更换保护柱的信号。由于保护柱属于耗材，当性能下降时，只需更换柱芯，无需更换整个色谱柱，这样可以节省成本并保持分析的连续性。

05 结构类似物实战中用哪些柱子分离呢？

李墨：选择哪种色谱柱取决于待分离分子的化学性质、大小、极性以及所需的分辨率和选择性。比如对于苯环类化合物，特别是卤代苯（如氯苯、溴苯等），使用苯基柱可以提高分离效果，对于苯环上的取代基团位置不同，也可以考虑使用五氟苯基柱等等。

06 怎么解决峰型异常的问题？比如分叉峰之类

李墨：在色谱分析过程中，我们可能会遇到一些常见的问题，如样品过载、溶剂使用不当、色谱柱污染或失效等。这些问题都可能会导致峰型异常，影响分析结果的准确性。解决办法可以考虑使用降低样品的载样量，比如降低它的浓度，或者减少样品的进样体积，或者更换样品溶剂等等，如果色谱柱出现污染或效能降低，更换新的色谱柱可以恢复分析的准确性和重复性。

07 李墨老师特别分享：保留因子K的公式推导过程
保留因子k：用固定相中的溶质分子总量，除以流动相中的溶质分子总量来得到。流动相和固定相中的分子量等于样品的浓度(Cs和Cm表示)乘以相的体积(Vs和Vm表示),因此可以引导出等式
k=(CsVs)/(CmVm)=( Cs/Cm)/( Vs/Vm)
=KΨ（k是平衡常数，Ψ是流动相和固定相的比值）
溶质分子肯定会出现在固定相或者流动相里,假设流动相里的溶质分子分数为R，在固定相的溶质分子分数就应该是1-R，因此就可以得到
k=(1-R)/R    
或者
R=1/(1+k)   
溶质分子X的保留时间可以定义为距离除以速度，这里的距离就是色谱柱的长度L，色谱带的速度是ux:
tR=L/ux
同样地,溶剂峰的保留时间就是
t0=L/u
式中,u是流动相的平均速度。把等式的L去除之后就衍生出下面这个等式
tR=t0u/ux
溶质分子X 通过色谱柱时的移动速率或者速度ux，可以通过计算在任何时间里出现在流动相内的该分子的分数R 来得出。一般来讲，ux应该等于R 乘以移动的速率或者溶剂分子的流动速度U:
ux=Ru0
所以用ux=Ru和R=1/(1+k)进行取代tR=t0u/ux,就得到下面的等式
k=(tR/t0)-1
式中tR 为化合物保留时间，t0为死体积时间

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