开篇引言

世界著名作家、大思想家斯宾塞·约翰逊曾经说过“唯一不变的是变化本身”，而在药物研发过程中，药物活性成分的合成往往伴随着杂质的生成，任何物质的纯净程度只能无限接近100%，在人类认知的范围内目前还不存在100%纯净的物质，换句话说“认知中可以存在的纯净物质那只有不纯物了”。

1 药物杂质与基因毒性杂质介绍

关于杂质，异于活性成分的物质我们将其统称为杂质，这些成分通常是无效的、与活性成分使用目的无关或者是有其他毒副作用的物质。而药物的质量研究过程就是通过目前人类所掌握的分析手段，对异于活性成分的物质进行定性和定量研究，并基于ICH、药典等相关指导原则并结合文献数据等手段对这些杂质进行安全限度的制定和评估，药物研发中的杂质可分为有机杂质（与工艺和药物结构有关的）、无机杂质和残留溶剂等。

杂质的存在通常会带来潜在的安全性风险，对患者来说有害而无益，其中高毒高活性杂质、基因毒性（致突变、致癌性等）杂质更是药物研发过程中的控制重点，其研究思路通常为杂质的定性、杂质的制备、结构确证与表征、限度制定、控制方式制定、高灵敏度的分析方法开发与验证等。

对于药物的研制原则，通常遵循ICH相关指导文件的研究思路，即人用药品注册技术国际协调会议（The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use; ICH）。

ICH是由欧盟、美国、日本三方成员国于1990年共同发起，对三方成员国家的人用药品注册技术要求的现存差异进行协调的国际组织。1994年3月15日，ICH Q3由指导委员会同意进入第二阶段，公开意见征求，药物研发过程中的杂质研究进入到了人们的系统关注中，从1995年3月30日开始，ICH相继发布Q3A（新原料药中的杂质）、Q3B（新制剂中的杂质）、Q3C（杂质：残留溶剂指南）、Q3D（元素杂质指导原则），建立了ICH成员国和遵循ICH原则国家的统一杂质研究标准，具体的提出了杂质控制策略和限度要求等内容^[1]。

随着科技的进步和分析手段的完善以及人们对学科的认识和对化合物的深入研究，发现某些杂质在极低的浓度下即可诱导基因突变并导致染色体的断裂和重排，具有潜在的致癌性，这类杂质人们将其定义为致突变杂质。Q3A和Q3B仅能为大多数杂质的定性和控制提供指导，对DNA反应性杂质的指导很有限，2013年2月6日，ICH M7（基因毒性杂质）获得执行委员会批准，并且发布供公众参考，为医药研发生产提供了一个用于致突变杂质的鉴别、分类、定性和控制的可行性框架方案，用于控制杂质潜在的致癌性风险。至此，ICH针对药物中杂质研究的框架已基本搭建完成。

根据致突变潜力和致癌性对杂质进行分类，通常以数据库和文献的检索获得的杂质致癌性和细菌致突变数据对实际和潜在杂质进行初步分析，危害性评估将其归类为1类、2类或5类。若无法获得这些数据，则应进行预测细菌致突变性的构-效关系（SAR）评估。根据评估结果将其分为3类、4类或5类^[2]。

上表中多次提到了警示结构，警示结构是化合物结构与生物活性的关系的研究总结的一系列结构，主要是结构与毒理学毒性的关系，需要注意的一点是，有警示结构的化合物不一定具有遗传毒性，有遗传毒性的化合物通常具有警示结构。

目前，一般将致癌物分成两大类：

一类是遗传毒性致癌物（geno-toxic carcinogens），通过化学键合直接破坏遗传物质产生致癌性，大多数的化学致癌物具有遗传毒性；

第二类是非遗传毒性致癌物（epicarcinogens，或称为外遗传性致癌物），通常不与DNA发生化学键合作用，不对DNA产生直接破坏，而是通过遗传物质外的间接机制引起致癌作用（如促进细胞过度增殖等），这类致癌物在致突变试验（如Ames试验）中一般呈阴性结果。

尽管非遗传毒性致癌物的致癌作用机制各不相同，但遗传毒性致癌物的作用机制却表现出较高的一致性，这类物质具有DNA反应活性，通过与遗传物质发生化学键合引起遗传信息的改变并产生致癌性，基因突变往往是此类物质产生致癌性的起始步骤。遗传毒性杂质的警示结构通常是指杂质结构中的某些特殊基团或结构分子。这些特殊的结构单元具有与遗传物质发生化学反应的能力倾向，一旦遗传物质发生改变则通常会诱导基因突变或者导致染色体重排或断裂，因此具有潜在的致癌/致突变风险。Ashby等总结提出了18种警示结构的模型，根据这18中警示结构整合成的“超级致癌物”虚拟化合物分子。

超级致癌物的虚拟结构

致突变杂质的安全阈值较一般杂质低很多，很低含量的情况下便可可能会引发致突变或致癌，因此对其控制要求更加严格，对工艺要求和对分析检测能力的要求也非常高。警示结构对于杂质的遗传毒性和致癌性具有提示作用，对于警示结构的早期识别和规避有助于提高药物研发的效率、降低生产和控制成本。正如上文所说，致癌性杂质可分为遗传毒性和非遗传毒性，在结构上可分为遗传毒性致癌性警示结构和非遗传毒性致癌性警示结构^[3]，如下表：

就像上文中所提到的，含有警示结构的化合物不一定具有遗传毒性，而有遗传毒性的化合物也不一定会产生致癌性。遗传毒性杂质的限度计算通常包含TD₅₀、TTC法等，篇幅有限这里不做更多的说明。

化合物是否具有遗传毒性，单单从是否含有警示结构上判断是不够科学也不够严谨的，还需结合化合物相关毒理学文献检索，杂质化合物软件评估预测以及Ames试验等进行判断，基于大量理论研究和实践经验总结出的警示结构，对于杂质的潜在致癌性有一定提示作用。因此在进行杂质安全性评估和控制策略选择时，对于缺少遗传毒性数据的杂质，警示结构作为区分普通杂质和“高活性”杂质的标志可以提高筛选效率、减少毒理学评价的工作量。但是应当指出，警示结构的存在与否并不能明确给出该杂质是否具有遗传毒性和致癌性的结论。对于缺少遗传毒性数据的杂质，警示结构可以作为辨识遗传毒性和致癌性杂质的起点，之后才会考虑启动构-效关系预测和体内外安全性研究，以进一步确认该杂质是否具有遗传毒性和致癌性。

2 美迪西设备技术和服务

美迪西是一家专业的生物医药临床前综合研发服务 CRO，其中药学研究板块CMC包括原料药研究、质量标准建立、稳定性研究和申报服务。在致突变杂质研究的方向，美迪西具有专业的杂质评估团队，可支持毒性试验研究、Ames试验，同时引入了专业结构评估软件 Case Ultra，软件同时包含基于统计学的和基于专家规则的模型，两个模型组合可以完整的满足ICHM7 要求。对于致突变杂质的研究，美迪西有专业经验丰富的杂质定性定量研究团队和国内先进的仪器设备,仪器包括 Bruker 400M HMR、Agilent 5977A GC-MS、Agilent 7000D GC-MSMS、Agilent/SHIMADZU/Thermo Fisher LC-MS、Agilent 6470 LC-MSMS、Thermo Fisher Q Exactive Plus HRMS 等。

3 美迪西案例分享

某原料药在合成制备工艺中，根据评估分析可能因试剂和工艺过程引入苯、烯丙基溴、烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷，根据ICH Q3C残留溶剂部分，苯归属于1类溶剂，属高毒高活性杂质，期限度为2ppm；烯丙基溴、烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷，根据结构判断其属于卤代烷烃类化合物，含有卤代烷烃警示结构，使用Case Ultra基于统计学的和基于专家规则的模型评估，软件模拟结果烯丙基氯和1-溴-3-氯丙烷杂质分类为1类，烯丙基溴杂质分类为2类。

查阅相关文献并结合原料药的最大使用剂量，从严控制杂质限度，最终确定苯的限度2ppm、烯丙基溴38ppm、烯丙基氯35ppm、1-溴-3-氯丙烷30ppm。

采用GC-MS定量检测，在Scan模式下确定各组分化合物的定性离子和定量离子。70eV条件，Scan模式下总离子流质谱信息如下：

在排除各组分化合物互相干扰的离子情况下，确定各组分的定性和定量离子，苯的定性离子m/z 51和m/z 77，定量离子m/z 78；烯丙基溴m/z 81和m/z 122，定量离子m/z 120；烯丙基氯m/z 75和m/z 78，定量离子m/z 76；1-溴-3-氯丙烷m/z 79和m/z 156，定量离子m/z 158。

定量模式SIM模式下，各组分化合物满足ppb级别极低的灵敏度要求。

[1] ICH Q3A(R2) 新原料药中的杂质

[2] ICH M7(R2) 遗传毒性杂质

[3] 马磊,马玉楠,陈震等.遗传毒性杂质的警示结构[j].中国新药杂志,2014,23(18):2106 2111)

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