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新闻资讯

美研| CMC系列(九) 定量核磁那些事儿：定量核磁应用及其方法验证

2023-12-18
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开篇引言

核磁共振是基于特定原子核（主要为I=1/2的1H、13C、15N、19F、31P等）在外磁场（1~21 Tesla，1 tesla=104guass）中吸收了与其分裂能级间能量差相对应的射频场能量而产生共振的原理。核磁共振兼具定性分析及定量检测两种优势，广泛应用于化学、食品、药品等领域。

01 定量核磁原理与应用

定量核磁技术（Quantitative Nuclear Magnetic，简称QNMR)主要是基于1H-NMR，待测化合物1H-NMR谱上各信号峰强度之比等于相应的质子数之比，确定氢的积分值与其摩尔浓度成正比，定量核磁方法分为相对定量法和绝对定量法。相对定量法是QNMR中最简单的，通过比较2种或2种以上成分特征峰的峰面积来确定含量；绝对定量法是以结构和含量已知的化合物为参照，与待测物制成溶液进行测定，通过比较两者的信号积分强度来确定待测物的含量，绝对定量法根据实验方法不同又分为内标法、外标法和标准加入法。

定量核磁技术在药学领域的应用有以下方面：

▲反应过程监测
▲对照品赋值
▲原料药含量测定
▲药物制剂的含量测定
▲药物的杂质检查
▲化合物纯度检查
▲多组分纯度确定
▲代谢组学研究
▲聚合物组成研究等。

定量核磁原理与应用.jpg

02 药典法规要求

2010版中国药典二部附录中首次提到核磁共振波谱法，2020版改为四部通则0441核磁共振波谱法。USP现行版、EP 10.8版、JP第18版和中国药典2020年版的NMR法通则内容对比如下表所示。中国药典2020年版0441通则包括原理、NMR仪、核磁共振谱、测定方法四部分。定量分析中提供了绝对定量模式和相对定量模式的供试品溶液制备方法、测定方法和计算公式，并简要例举了需要注意的实验参数的设置及优化项目。

内容
USP现行版<761>、<1761>
EP 10.8版2.2.33
JP 18版2.21
中国药典2020版0441
引言
简介、原理、适用范围
简介、原理
简介、原理
简介、原理
核磁仪器确认
DQ、IQ、PQ，系统适用性测试、确证测试
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定义
共振、信号、波谱、模式、峰、线、跃迁
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设备
磁体、探头(样品旋转、核磁共振管 )、控制台和计算机，仪器准备(磁体与场、探头调谐和匹配)
仪器组成(磁体、探头、控制台和计算机)、证明仪器正确工作的测试方法
FT-NMR波谱仪、连续波核磁共振(CW-NMR)波谱仪类型
仪器组成、仪器输出谱图的过程
测定方法
溶剂选择、样品处理
测定程序、样品处理
氢谱和碳谱的实验技术
溶剂选择、样品处理、样品检测
定性和定量分析
定性应用、定量应用(相对定量、绝对定量、外部校准、进一步的校准注意事项、一般程序、计量溯源性和标准物质的选择、样品制备、数据采集、数据处理、数据分析 )
定性分析、定量分析(内标法、规范化过程 )
-
定性和定量分析
•定性分析
•定量分析(绝对定量模式、相对定量模式)
采集参数
光谱宽度、停留时间、数据点数、采集时间、扫描次数、射频、接收器增益和脉冲宽度，后脉冲延迟，重复延迟
参数(脉冲宽度、死时间、采集时间、重复时间、接受增益 )
记录仪器和测定条件
-
采集后数据处理
增加信噪比或光谱分辨率、零填充、傅里叶变换定相、基线校正、采峰、积分、高级处理解
为定量目的优化采集和处理参数(数字分辨率、信噪比、整合区域、动态范围 )
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NMR分析方法的验证和确认
生命周期方法的分析方法验证
•ATP
•第一阶段一方法设计 (分析方法开发、QRMMODR、复制策略、分析控制策略 )
•第二阶段一APPQ(APPQ程序、测量不确定度APPQ结果和文档)
•第三阶段一CPPV (日常监测、分析方法的变更)传统分析方法验证(准确度、精密度、专属性、工作范围、定量限、耐用性、溶液稳定性 )、分析方法确认
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溶液核磁共振应用
结构解析和表征(示例 )、鉴别(示例)、定量(实验设计、样品制备、1D qNMR、2D qNMR )
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使用化学位移、谱峰多重性和相对强度进行鉴别，使用标准品进行鉴别
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SSNMR
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MAS、高功率去耦和CP三种技术和应用
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台式核磁共振仪
台式时域NMR仪、台式频域NMR仪、台式核磁共振应用
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03 定量核磁方法开发思路

1

氘代试剂

▲ 待测物及内标物在所选气代试剂中完全溶解;

▲ 关注待测物性质，不与气代试剂发生反应;

▲ 必要时可加入重水或TFA移除水峰干扰。

内标物的选择

▲ 内标物的选择由待测物出峰情况确定;

▲ 内标物定量峰与待测物出峰不重叠;

▲ 关注内标物化学性质，不与待测物反应

▲ 内标物样品性质稳定，定量峰峰型简单

2
3

定量峰的选择

▲ 定量峰与其他信号峰基线分离;

▲ 定量峰之间靠近，峰型接近，避免基线带来的干扰;

▲ 不选活泼区信号峰作为定量峰;

▲ 尽量避免卫星峰的干扰。

样品的前处理

▲ 为减少称量误差使用精密度高的分析天平称量，同时称量量在10mg以上;

▲ 如果样品活泼氢较多，可以滴加重水、氘代甲醇等试剂去除活泼氢;

▲ 样品完全溶解是必要的。

4
5

采集参数设置

▲ 扫描次数:保证定量峰的信噪比足够;

▲ 弛豫延迟:保证重复扫描时信号能够完全弛豫，一般为5倍以上的T1;三角形;

▲ 脉冲激发:O1P应在待测物和内标物信号频率之间，减少偏共振效应

实验数据处理

▲ 手动积分一般较自动积分准确;

▲ 避免卫星峰以及基线下杂峰的干扰;

▲ 必要时对基线、峰相位进行矫正，使峰型对称，减少积分误差;

▲ 内标物和待测物的定量峰积分应较为接近。

6
7

误差分析

▲ 待测物和内标物定量峰响应差距过大;

▲ 称量误差，最好保证样品称量值大于天平最小称量值的两倍以上;

▲ 仪器参数的影响，如共振偏移、AQ设置不当RG值设置过小等造成的影响。

交付验收

▲ 开具相关验收报告;

▲ 如有需要样品可以回收处理。

8

04 美迪西的设备技术和服务

美迪西核磁分析平台拥有强大成熟的分析设备、完整合规的样品检测分析流程、从目标化合物的制备到鉴定（结构确认）再到定量赋值（杂质COA）的一条龙服务。研究结果满足药物注册申报研究要求，同时积极配合客户完成审计及药监部门的现场核查工作。

美迪西的设备技术和服务.jpg

05 案例分享

江南·体育(JN SPORTS)官方网站研究团队累积了丰富的药物定量核磁研究，接下来随小编从以下两个案例，与大家共同探讨药物定量核磁方法学的研究。

案例一：API光照降解杂质对照品
制备后鉴定及QNMR赋值

项目背景

▲ API中的光照降解未知杂质结构鉴定及赋值；
▲ 目标杂质API中仅少量存在，需要进行干预破坏；
▲ 目标杂质制备后容易降解，考察其保存稳定条件；
▲ 制备出稳定状态杂质后进行结构鉴定及QNMR进行赋值；
▲ 交付结构鉴定报告及目标杂质标化COA。

目标杂质核磁图谱数据.jpg

目标杂质核磁图谱数据

目标杂质LCMSMS图谱.jpg

目标杂质LCMSMS图谱

案例二：定量核磁方法验证
交付中英文研究报告

项目背景

▲ 要求完成样品定量核磁方法开发及其验证；
▲ 进行专属性、系统适用性、准确度、线性、稳定性、精密度等验证；
▲ 交付中英文版验证方案、报告、完成样品检测。

定量核磁方法验证.jpg

美研|CMC系列回顾

❖CMC系列(一)|浅谈药物研发中原料药工艺研究的重要性

❖CMC系列(二)|药学研究之世界银屑病日

❖CMC系列(三)|高端吸入药物的市场格局和研究现状

❖CMC系列(四)|浅谈手性药物的研究策略

❖CMC系列(五)|药物晶型控制策略

❖CMC系列(六)|含氮类化合物-可挥发碱性有机胺的气相分析

❖CMC系列(七)|新药研究中的固态开发挑战及应对策略

❖CMC系列(八)|浅析ICH指导原则Q3C及未收录残留溶剂限度制定方法

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