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ADC药物解读（三）| 一文解析ADC药物研发难点

2022-07-19
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ADC药物结构复杂多样化，以及体内作用和代谢过程复杂性，这些为CMC研究、临床前研究等带来多重挑战。不同的肿瘤微环境不同，靶蛋白不同，对于ADC药物来说选用何种抗体、小分子毒素、连接子、连接方式等都需要进行特异性考虑。泛偶联时代，每一款偶联药物，都应该结合自身特点找准定位，形成差异化竞争策略，走创新化的研发之路，满足未被满足的临床需求。

❖    ADC药物设计要素

ADC是由抗体+连接子+小分子毒素三部分构成的复杂结构，这决定了它的制备工艺也会更为复杂。在制备和生产过程中，需要经历多个合成步骤，溶于多种溶剂，小分子毒素需要在这些过程中保持化学结构和性质稳定。ADC药物的成功通常取决于以下五大要素的设计：

靶向抗原

靶向抗原的选择是ADC药物设计的关键一环。需满足：

1、特异性，肿瘤细胞高表达、正常细胞低表达或不表达；

2、靶向抗原需为肿瘤细胞表面抗原；

3、高效诱导内在化过程（internalization）等。

理论上ADC药物可在肿瘤细胞外释放毒素，不经过细胞内在化，通过“旁观者效应”对肿瘤细胞造成杀伤。但实际上目前大部分ADC药物疗效的实现均是以内在化后的药物释放为基础。因此，ADC药物中的抗体和肿瘤细胞表面抗原结合后，ADC-抗原复合物需能有效诱导内在化过程，进入肿瘤细胞内，并通过适当的细胞内转运和降解过程，实现小分子药物的有效释放。

细胞免疫荧光Confocal检测ADC内在化.png

通过细胞免疫荧光Confocal检测ADC内在化

抗体

ADC药物中的抗体需要：

1、对所选抗原具有高度特异性。若缺乏特异性可能会造成脱靶毒性或被过早清除；

2、与靶向抗原的高亲和力；

3、低免疫原性，从而保证ADC药物在血液中有较长循环时间以及顺利进入肿瘤细胞。

连接子

连接子包括不可裂解 （non-cleavable） 连接子和可裂解 （cleavable）连接子两种类型。连接子需要考虑稳定性和释放效率的平衡。不可裂解连接子更具稳定性优势，可裂解连接子释放效率更高。

偶联技术

偶联技术通过连接子将抗体和小分子毒素连接到一起，涉及化学反应、抗体修饰与改造等相关技术。ADC药物所采用的偶联技术与其最终的药物抗体比率（Drug to Antibody Ratio；DAR）密切相关，而DAR的数值及其分布会显著影响ADC药物性质。DAR过大可能导致ADC药物聚集，进而在循环系统中被清除；DAR过小，可能导致ADC药物无法达到最佳治疗效果。DAR在2~4之间是ADC药物的最优选。目前，常用的偶联技术可分为随机偶联和定点偶联两大类。DS-8201采用定点偶联技术，药物抗体比高达8，具有更好疗效。

小分子毒素

小分子毒素是ADC药物发挥杀伤活性的主要成分。在选择小分子毒素时需综合考虑毒性、可修饰性等多个因素：1，与一般化药相比，具有更高毒性；2、可修饰性；3、适当的亲疏水平衡；4、高稳定性等。

❖    ADCC&CDC作用

ADC药物进入血液后，其抗体部分识别并结合靶细胞的表面抗原；随后ADC抗原复合物由内吞通路介导进入细胞。在细胞内，可裂解连接子对肿瘤细胞内的微环境敏感，会受 pH 值影响，或者被蛋白酶及某些化学物质裂解；携带不可裂解连接子的 ADC 药物被溶酶体消化，从而释放药物。某些 ADC 药物的小分子可以穿透细胞膜进一步杀伤周围的肿瘤细胞，即旁观者杀伤效应。此外，ADC 还具备 ADCC、CDC等抗体的免疫效应。

ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）是一种抗体依赖的细胞毒性作用，是免疫系统对抗病毒感染及肿瘤疾病的一种重要免疫防御机制。一般为自然杀伤细胞（NK）介导（有时中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也能介导ADCC作用），抗体Fab端结合靶细胞表面抗原，Fc端结合NK细胞表面的Fc受体CD16，将靶细胞与NK细胞拉近距离，并激活NK细胞释放颗粒酶和穿孔素等，最终导致靶细胞被裂解。

CDC（complement dependent cytotoxicity）是一种补体依赖的细胞毒性作用，由血清中大量存在的一系列补体蛋白 (C1-C9) 介导。C1q 与细胞表面抗体分子的 Fc 结构域结合而触发CDC反应。补体通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，激活补体经典途径，形成的攻膜复合物裂解靶细胞的作用。许多抗肿瘤抗体，如针对 CD20、CD52、人白细胞抗原 (HLA)-II 类、癌胚抗原 (CEA)、糖脂抗原等产生的抗体可诱导 CDC反应。

ADCC和CDC作用机制.png

ADCC和CDC作用机制[1]

❖    双靶点ADC

研究发现，双靶点 ADC 比两种单靶点ADC联合给药具有更好的治疗效果。双靶点 ADC 形式在治疗难治性乳腺癌和其他肿瘤方面非常具有潜力。比如，由Sutro Biopharma和EMD Serono共同开发的M1231是一款靶向EGFR和MUC1的双特异性抗体ADC。M1231通过可裂解的Val-Cit SUTRO链接子与Hemiasterlin细胞毒素相连。Hemiasterlin 是一种三肽，通过与微管蛋白结合发挥其细胞毒性，从而破坏正常的微管动力学。

再比如，下文中科研人员通过设计带有叠氮化物和甲基四嗪基团的新支链连接子作为正交点击反应位点。加上有效载荷模块（包括作为点击对的 DBCO 或 TCO、PEGn、GluValCit 可裂解接接子、PABC 基团和毒素分子 MMAE 或 MMAF）。合成了具有双效载荷的均质 ADC。GluValCit 连接子系统确保了 ADC 在体内的功效，同时最大限度地降低了动物血浆中连接子的过早降解。选择 MMAE 和 MMAF 的双重偶联物使 ADC 能够靶向作用于多种乳腺癌细胞。

双靶点ADC分子设计和偶联策略.jpg

双靶点ADC分子设计和偶联策略[2]

❖    ADC旁观者效应

ADC 药物通过抑制肿瘤DNA复制或阻滞细胞周期诱导肿瘤细胞死亡。ADC药物进入血液循环后，与肿瘤细胞表面靶向抗原受体结合，形成ADC抗原复合物，被肿瘤细胞内吞，进而经过溶酶体降解，细胞毒素在胞内释放，结合至DNA小沟或微管蛋白，抑制肿瘤DNA复制或阻滞细胞周期，诱导肿瘤细胞死亡。疏水性小分子毒素还可以通过细胞膜扩散，对邻近肿瘤细胞产生杀伤活性，称为旁观者效应。

ADC药物的旁观者效应示意图.jpg

ADC药物的旁观者效应示意图[3]

SYD985 和 T-DM1 都是靶向HER2 的ADC药物，SYD985 因其更强的旁观者效应而在细胞毒性测定中更有效。KRCH31 细胞是 HER2 阳性，ARK-4 细胞是 HER2 阴性，两种细胞系进行共培养（用染料标记），然后进一步进行 FACS 分析细胞死亡。数据显示，SYD985会导致旁观者细胞（ARK-4）的杀伤。如下图所示，当使用SYD985处理 KRCH31 细胞与 ARK-4 共培养时，KRCH31 的杀伤力没有增加，但 KRCH31/ARK-4 的共培养使HER2 低/不表达的 ARK-4 细胞的旁观者效应显著增强。当使用 T-DM1处理  KRCH31/ARK-4 共培养物96 时，检测到最低程度的旁观者细胞毒性。

体外旁观者效应.png

体外旁观者效应[4]

美迪西生物团队拥有200多肿瘤癌细胞系，多种可供选择的ADC靶蛋白表达阳性和阴性的肿瘤细胞。此外，美迪西生物团队拥有丰富的细胞标记经验及基于 FACS 的细胞活力分析能力。

❖    ADC药物CMC研究

包括4部分：

1、抗体；

2、载药-连接子中间体；

3、ADC原料药；

4、制剂部分。

此外还需要引入一些特殊的质量控制指标。如药物与抗体的比率，载药与抗体的连接位点以及ADC药物中的药物负载分布等。此外，ADC中游离的载药和抗体需要进行量化控制，载药连接抗体后对抗体和靶点结合效力的影响以及ADC在人体血浆中的稳定性也需要进行研究。

❖    ADC临床前研究相关种属的选择

一般情况，整体ADC的毒性研究可在一种动物种属中进行研究。同时需要考虑其中小分子化合物和抗体药物的双重属性。如果小分子化合物为新化合物或者毒性特征不明确，则至少需要在一个相关动物种属中对其毒性进行单独考察，可以单独开展试验，也可以在ADC的毒性研究中设置单独给药组。如果小分子化合物为已上市药物，无需对其毒性进行单独研究。若抗体部分靶向全新的靶点或者具有特殊安全性担忧时，应考虑采用转基因动物或替代分子对抗体的靶向药理作用、Fc效应，以及靶向释放小分子化合物所带来的潜在毒性反应进行研究。美迪西可帮助客户完成：ADC药物的血浆稳定性及体外溶血试验、药效学研究、药代动力学、毒性研究、及安全性评价等全套研究。

美迪西在ADC的临床前一体化研究方案制定中与客户深入交流，科研骨干将每一个案例的特点与多年实战经验和技术积累相结合，谨慎地将优质实验方案与结果提交到客户手上。截至目前，美迪西承接的IND申报类生物药大项目已经100多项；包括单抗、双抗、多抗、ADC、病毒疫苗和融合蛋白等。截至2022年5月，美迪西已成功助力10个ADC药物获批临床，并有多个ADC项目在研。美迪西已完成毒素小分子：DM1，MMAE、Exatecan、Dxd，SN38等。美迪西已完成靶点：Her2、Her3、Trop2、Claudin 18.2、CD33、Muc1、FR等。

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